基因過表達與基因沉默是研究特定基因功能的兩大技術手段。siRNA又稱小干擾RNA（Small interfering RNA；或 short interfering RNA；或silencing RNA），指能引發RNA干擾效應的短雙鏈RNA（經典結構為19nt序列特異區域+2nt 3’懸掛，一般在20-25bp，也有一些20-30bp）；可以由細胞內源產生，也可以由外源導入。通過與體內相關酶形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）降解目標mRNA，調低或抑制目標基因的表達。siRNA 于 1999 年由 David Baulcomb 實驗室首次發現。2001 年，Thomas Tuschl 提出合成 siRNA 會在哺乳動物細胞中誘導 RNA 干擾 (RNAi)。

siRNA作用機理

  首先，外源性或內源性雙鏈RNA（dsRNA）被RNaseIII（例如Dicer）切割成約21-25nt具有活性的siRNA結構。隨后，Dicer將在RNA結合蛋白TRBP的幫助下將雙鏈siRNA加載到Argonaute（AGO2）蛋白，形成復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。然后，siRNA將解開雙鏈，其反義鏈與靶mRNA結合后，AGO2將特異性降解靶mRNA，從而抑制其翻譯。最后，被切除的靶mRNA被釋放，RISC被回收，使用相同的加載引導鏈再進行幾輪切片。此外，siRNA可以在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，從而重新參與以上過程。

    shRNA載體構建

     shRNA，短發卡RNA（short hairpin RNA），是指插入到相應表達載體（比如慢病毒）中的針對目的基因的特定序列（經過設計和篩選的高效且特異抑制目的基因）和特定結構（由loop序列區隔開的反向重復序列），在體內啟動轉錄，形成發卡結構，在體內的DICER及RNase作用下，形成siRNA并誘導RNA干擾抑制特定基因表達。它通常由3個元件構成：一個轉錄啟動子，一個shRNA前體序列和一個轉錄終止信號。shRNA具有較強的基因沉默能力，在體內轉錄后經過酶切形成siRNA分子，通過與RNA干擾復合體（RISC）結合，降解特定的mRNA分子，進而對特定基因表達進行調控。shRNA技術已廣泛應用于基因功能研究和基因治療等領域。

shRNA的特點

1.靶向性強

理論上，shRNA能夠對目標基因進行特異性的抑制，而不影響其他基因的表達，在基礎研究和臨床治療中有著廣泛的應用前景。

2.適用范圍廣

shRNA可以用于多種類型的細胞和生物體系中，并且能夠針對多種不同的基因進行沉默。因而使得shRNA成為了研究和治療各種疾病的重要手段。

3.操作簡單

與其他基因敲除技術相比，shRNA的設計、合成和操作相對簡單。通常只需要將shRNA序列克隆到質?；虿《据d體中，然后導入到細胞內即可實現基因沉默效應。

4.抑制效果持久

shRNA可以在細胞內誘導長期的基因沉默效應，其抑制效果可以持續幾天甚至數周。這種特點使得shRNA成為了研究和治療需要長期監測的疾病的重要工具。

5.可視化的細胞轉染效率

通過與熒光蛋白如GFP共表達，可以快速篩選質粒轉染或病毒感染陽性的目的細胞，大大提高篩選效率。

shRNA較之siRNA具有細胞內表達更穩定，抑制靶基因作用更長久并可傳遞給子一代等優勢，解決了siRNA無長期穩定沉默目的基因的缺陷。