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    Western Blot

      發布時間: 2022-04-15      瀏覽量:363
    WB ,Western blot

           Western Blot即蛋白質免疫印跡法,也稱Western、Western blotting、Western印跡,常簡寫為WB,是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從聚丙烯酰胺凝膠轉移到固相支持物PVDF或NC膜膜上,然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術,現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。上海賽瑞格擁有專業的技術團隊,多年的Western Blot試劑研發經驗,可以針對客戶的不同需要設計不同的實驗方案,提供最快捷優質的服務。

          Western Blot基本原理:

          Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離的蛋白質樣品,通過轉膜方式轉移到固相載體(如PVDF、NC膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶標記(通常是HRP)的第二抗體起反應,經過底物化學發光試劑(如ECL)發光或顯示試劑(如DAB)顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

    TP12-Western blot.jpg

         服務承諾

         (1)在最短的時間內快速將實驗完成。

    1.      (2)根據總蛋白定量的結果,微調各個樣本間濃度差異,高溫變性,加入loading buffer,上樣跑膠,以及轉膜顯色等步驟。
    2.      (3)利用軟件對所得膠片進行掃描,用相對定量方法進行定量分析時,要對管家蛋白等參比蛋白進行同樣操作,用所得到的值進行蛋白量的校正,最后求得目的蛋白的相對表達量。
    3.      (4)提供實驗報告:包括詳細的實驗方法及western blot結果的相關圖表。
    4.      (5)保證檢測結果準確、客觀、可信,但不能確保一定要得到某特定結果。


         客戶提供
    1.      (1)客戶須在實驗開始前確保其細胞或組織中有目的蛋白的表達,并提供目的蛋白的相關信息(蛋白名稱、大小等信息),盡可能詳細的背景資料,包括蛋白的種屬、大小、參考文獻等。
    2.      (2)客戶應對所提供的材料及信息負責,如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
    3.      (3)新鮮樣品(組織為100-150 mg/樣,細胞>107 個/樣),若為凍存樣品,請于-70 ℃以下保存并自備液氮以便運輸。一抗,標明來源和稀釋度,也可讓我司代買。
    4.      (4)WB所需要的目的蛋白的一抗,可自行提供,或在本公司購買相應指標。


         技術路線

         蛋白免疫印跡一般由樣本處理、凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測組成。

    Wb-2.png


    常見問題及解決方案:

    常見問題可能原因解決方法
    條帶呈笑臉狀凝膠不均勻冷卻,電泳時中間比兩側更熱降低電泳時的電壓
    條帶呈皺眉狀凝膠和玻璃擋板底部有氣泡;兩邊聚合不完全電泳槽中加電泳液時排空玻璃擋板下方的氣泡;配膠時充分混勻
    拖尾樣本中蛋白溶解不好上樣前對樣本煮沸5min,離心1min
    出現紋理(縱向條紋) 樣本中含有不溶性顆粒上樣前對樣本煮沸5min,離心1min
    條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜;凝膠不均勻凝固在未加樣孔中加入等量樣品緩沖液,配膠時充分混勻
    條帶彌散上樣時樣品被電泳緩沖液稀釋;濃縮膠配制出錯或梳齒底部過短 上樣時自底部往上緩緩加樣;使用新配制AP,按照配方配濃縮膠;梳齒底部至分離膠頂約1.0~1.5cm
    條帶寬窄不均蛋白濃度不同,上樣時體積差異過大濃度高的樣本中補充1*上樣緩沖液至各樣本體積大致相同
    沒有陽性條帶一抗或二抗失效更換抗體,選擇現配現用工作液
    一抗/二抗不匹配更改為同種屬及同亞型的抗體底物
    發光液失效更換新的發光液
    標本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低 設置陽性對照,確定樣本中是否含靶蛋白;增加標本上樣量解決靶蛋白含量低
    抗體染色不充分增加抗體濃度;延長孵育時間
    溶液中有辣根過氧化酶抑制劑所有溶液和器皿中避免含有疊氮化鈉
    抗體活性降低選擇在有效期內的抗體;工作液現配現用,避免長時間放置
    有陽性條帶,但條帶比較弱 樣本中目的蛋白含量太低增加標本上樣量
    洗膜過度縮短洗滌時間
    曝光時間過短延長曝光時間
    封閉過度減少封閉劑的量或縮短時間;換用不同封閉劑類型
    蛋白轉移不充分 優化轉膜條件;調整轉膜時間;嚴格按照配方配制轉膜液體;如為PVDF膜,需提前用100%甲醛浸泡
    背景高洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數;洗滌液中加入Tween-20
    二抗濃度過高降低二抗濃度
    二抗的非特異性背景 不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統來源;重新選擇二抗
    封閉不充分增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑
    抗體與封閉蛋白有交叉反應更換封閉劑;洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應
    曝光過度
    檢測過程中膜干燥
    縮短曝光時間
    保證充分的反應液,避免出現干膜現象
    非特異性條帶(多條帶) 抗體濃度過高降低抗體(一抗、二抗)濃度
    一抗的特異性不夠使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性
    二抗的非特異性結合 不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統來源;重新選擇二抗
    蛋白上樣量過大降低上樣量
    蛋白降解避免反復凍融;使用新鮮制備的標本,并使用蛋白酶抑制劑
    不同剪切體存在分析不同剪切體的大小并核對
    細胞傳代過多,導致蛋白變異使用原代或傳代少的細胞作對照
    背景有不均勻白色斑點轉膜過程中有氣泡存在仔細檢查,避免存在氣泡
    抗體分布不均勻孵育抗體時使用搖床


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