一、概述

CUT&RUN，全稱為Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease，由美國Fred Hutchinson癌癥研究中心的Steven Henikoff團隊開發。該技術的主要特點是，它可以在完整的細胞或細胞核上進行，無需甲醛固定或超聲處理。細胞經過透化處理（擴孔）后與目標抗體孵育，抗體進入核內與目標蛋白結合；細胞再與蛋白A/G連接的MNase孵育，目標抗體Fc段結合Protein A-MNase或Protein A/G-MNase。然后激活MNase酶切割結合位點兩邊的染色質，這些經過切割的片段擴散到細胞核外，而未切割的部分留在核內，可大大降低背景。之后從上清液中收集DNA片段并測序。

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）是一種研究蛋白質與DNA互作的新方法。該方法通過分子生物學手段將高活性的Tn5轉座酶與Protein A融合，并裝載建庫接頭引物形成pA-Tn5轉座復合物。在抗體的引導下該pA-Tn5轉座復合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列。與傳統ChIP-Seq相比，該技術無需交聯與超聲打斷操作，規避了其所引起的抗原決定簇遮蓋和樣本損失問題，提高了信噪比，并使所需細胞量減少（可低至60個）。與CUT&Run相比，該技術在pA-Tn5轉座復合物進行切割時在切割片段的兩端加上接頭序列，可直接PCR建庫，無需末端抹平和接頭連接的操作，省時高效。CUT&Tag技術可從基因組范圍內檢測組蛋白、RNA polymerase II和轉錄因子等蛋白質結合的DNA區端，應用于臨床和科研的表觀遺傳學研究?；蚴墙Y合生物信息學分析，找到轉錄因子下游調控的靶基因，為進一步闡明生物學機制提供依據。  

二、實驗流程

CUT&Tag

細胞先與包被刀豆蛋白A的磁珠(Concanavalin A-coated magnetic beads, ConA beads)吸附結合，方便后續操作。用非離子去污劑洋地黃皂苷(Digitonin)進行細胞穿孔后，依次孵育針對靶蛋白的一抗、相應的二抗、pA-Tn5融合蛋白。其中pA-Tn5中的pA可以識別二抗的Fc區域,Tn5酶在加入Mg²⁺后定向切割靶蛋白附近的DNA序列。且Tn5酶進行切割時會在切割片段的兩端加上接頭序列，因此切割產物可以直接PCR擴增建庫，經純化后用于高通量測序。

CUT&RUN

（1）未固定的核結合在lectin coated磁珠上；

（2）先后與抗體和蛋白A-MNase（pA-MN）孵育，其次是簡單的洗滌；

（3）在冰上與Ca++混合，啟動裂解反應，之后利用螯合作用停止數秒到數分鐘；

（4）離心包含釋放的TF-DNA復合物的上層清液，從而進行恢復。

（5）提取上清液中的DNA，建庫測序。

上機測序

庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求 pooling 后進行 Illumina NovaSeq 測序。測序基于邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis）的原理，在測序的 flow cell 中加入四種熒光標記的 dNTP、DNA 聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的 dNTP 就能釋放出相對應熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。測序過程如下圖所示：

生物信息分析流程

測序數據下機之后，獲得原始測序序列（Raw data），在有相關物種參考序列或參考基因組的情況下，通過如下圖標準流程進行生物信息分析：

三、應用范圍

一般使用新鮮細胞、梯度凍存細胞、新鮮組織或是冰凍組織進行實驗，可以廣泛應用于哺乳動物的蛋白與DNA互作研究。酵母和植物等生物類型可經由破除細胞壁或者提取細胞核來進行實驗。

四、技術優勢

       （1）實驗材料無需交聯，原位（In situ）操作；

       （2）信噪比高，所需測序深度減少，性價比高；

       （3）實驗可重復性好；

       （4）省時高效，從細胞收集到測序文庫構建僅需1-2天。

五、結果展示

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